分子克隆基础认知
分子克隆(molecular cloning)是指在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DN**段的方法。用体外重组的方法将目的基因插入克隆载体,形成重组克隆载体,通过转化与转导的方式,引入适合的寄主体内得到复制与扩增,然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体,可以得到插入DNA的许多拷贝,从而获得目的基因的扩增。
将DN**段(或基因)与载体DNA分子共价连接,然后引入寄主细胞,再筛选获得重组的克隆,按克隆的目的可分为DNA和cDNA克隆两类。
cDNA克隆是以mRNA为原材料,经体外反转录合成互补的DNA(cDNA),再与载体DNA分子连接引入寄主细胞。每一cDNA反映一种mRNA的结构,cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。特点是:
①有些生物,如RNA病毒没有DNA,只能用cDNA克隆;
②cDNA克隆易筛选,因为cDNA库中不包含非结构基因的克隆,而且每一cDNA克隆只含一个mRNA的信息;
③cDNA能在细菌中表达。cDNA仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息,只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。
DN**段的制备
常用以下方法获得DN**段: ①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DN**段;②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段;③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下,用人工方法合成对应的基因片段;④从mRNA反转录产生cDNA。
载体DNA的选择
①质粒:质粒是细菌染色体外遗传因子,DNA呈环状,大小为1-200千碱基对(kb)。在细胞中以游离超螺旋状存在,很容易制备。质粒DNA可通过转化引入寄主菌。在细胞中有两种状态,一是“紧密型”;二是“松弛型”。此外还应具有分子量小,易转化,有一至多个选择标记的特点。质粒型载体一般只能携带10kb以下的DN**段,适用于构建原核生物基因文库,cDNA库和次级克隆。
②噬菌体DNA:常用的λ噬菌体的DNA是双链,长约49kb,约含50个基因,其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的,分布在噬菌体DNA两端。中间是非必需区,进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。
M13噬菌体是一种独特的载体系统,它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌,但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子,象质粒一样自主复制,制备方法同质粒。寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体,又能方便地制备单链DNA,用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交。
③柯斯(Cos)质粒:是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体-质粒混合物。此类载体分子容量大,可携带45kb的外源DN**段。也能象一般质粒一样携带小片段DNA,直接转化寄主菌。这类载体常被用来构建高等生物基因文库。
DN**段与载体连接
DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要步骤:
①粘性末端连接,DN**段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端,用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样,有些限制性内切酶虽然识别不同顺序,却能产生相同末端;
②平末端连接,用物理方法制备的DNA往往是平末端,有些酶也可产生平头末端。平头DN**段可在某些DNA连接酶作用下连接起来,但连接效率不如粘性末端高;
③同聚寡核苷酸末端连接;
④人工接头分子连接,在平头DN**段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段,经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。
连接反应需注意载体DNA与DN**段的比例。以λ或Cos质粒为载体时,形成线性多连体DNA分子,载体与DN**段的比例适当增加。以质粒为载体时,形成环状分子,比率常为1∶3。
引入寄主细胞
常用两种方法:①转化或转染,方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞(通常为感受态细胞)混合置于冰上,待DNA被吸收后铺在平板培养基上,再根据实验设计使用带抗性的培养基筛选重组子,通常重组分子的转化效率比非重组DNA低,原因是连接效率不高,有许多DNA分子无转化能力,而
且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大,转化困难。②转导,病毒类侵染宿主菌的过程称为转导,一般转导的效率比转化高。
克隆的选择
①直接筛选:有些载体带有可辨认的遗传标记,能有效地将重组分子与本底区分。②间接筛选:载体分子带有一个或多个抗药性标记基因,当外源DNA插入到抗药基因区后,基因失活,抗性消失。③核酸杂交:广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。④免疫学方法:如果重组克隆能在宿主菌中表达,就可以用特异的蛋白质抗体为探针,进行原位杂交,选择特异的克隆。
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