发表日期：2023年04月12日
发表期刊：Molecular Plant
影响因子：21.949
研究方法：LC-MS/MS检测核酸修饰水平、acRIP-seq 等
研究思路图
1、拟南芥和水稻的 mRNA 上存在 ac4C 修饰
首先，作者使用 ac4C dot blot 实验证明了拟南芥和水稻幼苗当中存在与人类 Hela 细胞当中相当水平的 ac4C RNA 修饰，且丰富随着发育时间存在动态变化。随后，作者使用LC-MS 再度检测了拟南芥和水稻幼苗当中提取的总 RNA 和 mRNA，其中拟南芥总 RNA 中有 0.6% 的 ac4C/C% 占比，mRNA 中有 0.4% 的 ac4C/C% 占比；水稻总 RNA 中有 0.6% 的 ac4C/C% 占比，mRNA 中有 0.3% 的 ac4C/C% 占比。这些发现证实拟南芥和水稻当中普遍存在的 ac4C RNA 修饰，并且这种修饰不仅位于非编码 RNA 上，而是在 mRNA 上亦广泛存在。
2、选用 acRIP-seq 技术进行后续研究
为了高通量地研究 RNA 上的 ac4C 乙酰化修饰，存在多种不同的实验方法，包括使用 ac4C 抗体富集的 acRIP-seq方法（Acetylated RNA Immunoprecipitation Sequencing），以及使用化学试剂处理引发 ac4C 到 T突变的 ac4C-seq。为了验证两种方法的效果，作者设计了一段带有单个 ac4C 修饰位点的体外转录本（in vitro transcript，记作“IVT”），将其掺入植物样品来源的 RNA 中当作外参。当 IVT 与植物总 RNA 比例为 1：1 时，acRIP-seq 和 ac4C-seq 两种测序方法都可以有效检出 IVT 上的 ac4C 修饰。然而，当 IVT 与植物总 RNA 比例为 1：5000 时，ac4C-seq 无法检出 IVT 当中的 ac4C 修饰，只有 acRIP-seq 在 1：5000 的低浓度时仍然能检测到 IVT 上的 ac4C 修饰。考虑到生物体内 ac4C 的发生比例较低，需要灵敏检出低丰度的 ac4C 修饰，因此作者后续与云序生物合作，采用了 acRIP-seq 作为 RNA 样品乙酰化修饰高通量测序的方法。
3、拟南芥和水稻的 ac4C 乙酰化谱
通过 acRIP-seq，作者在外源的 IVT 以及内源的 rRNA 上都检测到了理论预测要出现的 ac4C 峰，证明该实验方法的可靠性。acRIP-seq 结果显示，ac4C 修饰广泛分布在拟南芥和水稻的整个基因组的各个染色体上。
无论是拟南芥还是水稻，其 ac4C 乙酰化峰都集中分布于起始密码子附近，亦在整个 CDS 区具有较高丰度。该现象与早前在哺乳动物当中报道过的 ac4C 修饰分布情况类似，暗示可能存在进化上的保守性。无论是拟南芥还是水稻，单个转录本上的 ac4C 峰个数都存在递减现象。
4、拟南芥和水稻 ac4C 修饰基因的比较
为了研究植物中RNA ac4C修饰的进化保守性和潜在功能，作者比较了拟南芥和水稻中ac 4C的修饰基因。GO 分析显示，拟南芥和水稻当中的 ac4C 修饰基因具有一定的相似性，重复出现的 GO 条目包括核糖体生物发生（ribosome biogenesis）、光合作用（photosynthesis）、糖酵解（glycolytic process）以及对植物激素的反应（response to phytohormone）等。拟南芥的 ac4C 修饰基因特有富集的 GO 条目与RNA结合（RNA binding）以及应激反应（stress response）有关，而水稻 ac4C 修饰基因特有富集的 GO 条目则与翻译（translation）活动相关。在拟南芥的 2160 个 ac4C 乙酰化基因当中，有 1574 个在水稻当中存在同源基因；而在水稻的 3824 个 ac4C 乙酰化基因当中，有 2619 个在拟南芥中存在同源基因。有多达 634 个 ac4C 乙酰化基因在拟南芥和水稻当中同时被检测到，其中有一个编码超氧化物歧化酶的基因，在拟南芥当中未 AtSOD2，在水稻当中的同源基因为 OsSOD4，它们的起始密码子附近都有检测到一个非常明显的 ac4C 乙酰化峰。此外，也存在一些物种特异性的 ac4C 乙酰化峰，例如拟南芥当中的 PIN3 基因和水稻中的 OsIAA21 基因。
根据以往的报道，在哺乳动物当中，RNA 的 ac4C 乙酰化修饰可能存在共同的基序（motif）特征。为了探明在植物当中是否也存在 ac4C 特征 motif， 作者对拟南芥和水稻进行了 ac4C motif 分析，结果发现：在拟南芥当中，HYCHYCWYCWYC 和 CUUCUUCYUCYU 是最常见的 RNA ac4C 乙酰化 motif；而在水稻当中，CBHCAAGNHC、SVAGHHSUAC 和 CNNCNNCNNC 是最常见的 RNA ac4C 乙酰化 motif。在拟南芥和水稻两个物种之间，则存在 CCAA 这样一个共有的 RNA ac4C 乙酰化 motif。然而，在 UTR 区域，几乎找不到共有的 motif 特征。综上所述，作者认为植物的 RNA ac4C 乙酰化修饰即存在跨物种保守性，也存在一定的物种特异性。
根据以往的报道，在人类当中，RNA 的 ac4C 乙酰化修饰受 NAT10 酶的催化。为了探明植物当中 NAT10 的同源物，作者使用人类 NAT10 蛋白全长通过 BLAST 寻找其在拟南芥和水稻当中的同源蛋白。通过一系列后续实验，作者证明了AtNAT10a 和 AtNAT10b 是拟南芥的 NAT10 同源蛋白，且这两个基因的敲除在拟南芥中是致死的；而在水稻当中，NAT10 的同源蛋白是osNAT10，它调控水稻幼苗的发育，影响水稻穗（panicles）的数量，并最终影响到产量的提高。
5、植物 RNA ac4C 修饰的功能：增强 RNA 稳定性和调控可变剪接
根据以往已发表的文献，作者发现 ac4C 修饰的 mRNA 拥有更长的半衰期。为了验证这一结论是否在植物当中成立，作者在拟南芥和水稻当中使用转录抑制剂放线菌素D（actinomycin D）以抑制新 mRNA 的生成，并在此基础上检测原有 mRNA 的留存水平。在水稻当中，5 个 ac4C 修饰的基因 (Os05g0103400, Os02g0509500, OsSOD4, OsTMK 和 OsIAA21) 在野生型（WT）当中都比乙酰化修饰抑制型（osnat10-1）表现出更高的 mRNA 稳定性。在拟南芥当中，ac4C(+) 基因（AT1G09310 和 AT2G28190）亦表现出比 ac4C(-)基因（At1G69960 ，即 PP2A）更高的稳定性。为排除放线菌素D对 RNA 乙酰化修饰的影响，作者还进行了 ac4C dot blot 实验，在放线菌素D处理组和 mock 组之间观测到近似的 ac4C 修饰水平。综上所述，作者认为 RNA 的ac4C 修饰提升了 mRNA 的稳定性。除此之外，作者亦通过其它一系列实验证明了 RNA 的 ac4C 乙酰化修饰促进了 RNA 的可变剪接，提供了更加丰富的可变剪接转录本类型。
6、植物 RNA ac4C 修饰的功能：促进翻译和抑制空间结构
RNA 修饰除了可能影响转录本的稳定性和可变剪接以外，还可能影响到蛋白质的翻译效率。作者通过 RNC-mRNA-seq 实验发现，ac4C(+) 基因的翻译效率要显著高于 ac4C(-) 基因，且 UTR 区域发生 ac4C 修饰的基因的翻译效率要显著高于 CDS 区域发生 ac4C 修饰的基因。如果进一步细分 CDS 区域，将前 10% 定义为 “near 5’UTR”，将中间的 10% 定义为 “middle”，将后 10% 定义为 “near 3’UTR”，则“near 5’UTR”和“near 3’UTR”上发生 ac4C 修饰基因的翻译效率要显著高于“middle”类型。综上所述，作者认为 UTR 区域以及 CDS 上接近 UTR 的区域上的 ac4C 乙酰化修饰将起到提升翻译效率的作用。在野生型与乙酰化修饰抑制型（osnat10-1）之间比较可以发现，ac4C(+) 基因在野生型当中的翻译效率要高于乙酰化修饰抑制型。作者挑选了两个拟南芥的 ac4C 修饰基因（HIRD11 和 AT2G15960）和两个水稻的 ac4C 修饰基因（Os05g0103400 和 Os02g0509500），发现其 ac4C(+) 修饰型转录本比 ac4C(-) 未修饰型转录本的蛋白表达量都要高，且在水稻当中的提升倍数比拟南芥中更大，暗示水稻中的 RNA ac4C 修饰与翻译效率之间的关联比在拟南芥中更强。除此之外，作者亦通过其它一系列实验证明了 RNA 的 ac4C 乙酰化修饰与 RNA 的空间结构之间存在负相关的关系，即 ac4C 乙酰化修饰的 RNA 更倾向于拥有简单的单链结构。
小 结
作者通过 LC-MS 以及 acRIP-seq 等技术，在双子叶植物代表物种拟南芥（Arabidopsis thaliana）和单子叶植物代表物种水稻（Oryza sativa）当中的 mRNA 上 ac4C 乙酰化修饰的普遍存在，并揭示了其乙酰化修饰谱的基本特征。本项研究发现，在拟南芥和水稻当中，RNA 的 ac4C 乙酰化修饰可提高 mRNA 稳定性，促进 RNA 可变剪接，提升蛋白翻译效率，并减少 RNA 出现空间结构。该论文拓展了 RNA ac4C 乙酰化修饰的物种研究范围，揭示了 RNA ac4C 乙酰化修饰在双子叶植物和单子叶植物当中的普遍存在及其生物学功能。
云序生物ac4C修饰研究六大模块
01 ac4C RNA修饰测序ac4C RNA修饰测序
对ac4C RNA乙酰化，目前最流行的检测手段为acRIP-seq技术，适用于ac4C RNA乙酰化谱研究，快速筛选ac4C RNA乙酰化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的ac4C测序：
- ac4C 全转录组测序（涵盖mRNA，LncRNA，circRNA）
- ac4C LncRNA测序（涵盖LncRNA和mRNA）
- ac4C Pri-miRNA测序（涵盖Pri-miRNA和mRNA）
- ac4C mRNA测序
- ac4C rRNA测序
- ac4C circRNA测序
- ac4C tRNA测序
LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平
精准高效，可以实现一次检测，9类修饰水平检测，一步到位。
03 ac4C RNA修饰上游酶的筛选
ac4C RNA修饰相关酶PCR芯片
寻找上游直接调控ac4C RNA乙酰化的甲基转移酶。
04 ac4C RNA修饰靶基因验证
acRIP-qPCR
云序提供acRIP-qPCR服务，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证靶基因RNA修饰水平。
05 机制互作研究
RIP-seq/qPCR
筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。
RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。
06 翻译组
Ribo-seq（核糖体印记测序）
捕获核糖体保护的 mRNA 片段，助力探索蛋白质合成的基因表达调控机制。
云序生物服务优势
优势一：云序累计支持客户发表百余篇RNA修饰SCI论文，合计影响因子1000+, 其中RNA乙酰化测序有多达4篇影响因子接近20 分的高分论文。优势二：累计完成数千例 RNA甲基化测序样本，全面覆盖医口、农口等各类样本。
优势三：检测mRNA和各类非编码RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
优势四：提供ac4C一站式服务：ac4C整体水平检测、acRIP-seq、acRIP-qPCR验证、RIP和RNA pull down等。
优势五：率先研发超微量acRIP测序技术，RNA量低至500ng起。
优势六：国内较全的RNA修饰测序平台，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、m6Am、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化测序。
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