脑膜瘤（Meningiomas，MGMs）由脑膜皮细胞（蛛网膜细胞）构成的肿瘤，发生于硬脑膜内表皮，是常见的中枢神经系统肿瘤。多分布在高领人群中，且女性发病率为男性的2.3倍。脑膜瘤WHO分为3级，临床中80%-90%的脑膜瘤都属于良性，也就是属于WHO分级中的Ⅰ级。但在临床中也有5%-15%的脑膜瘤是属于WHO分级当中的Ⅱ级。1%-3%的脑膜瘤属于分化不良型，也就是在WHO分级中属于Ⅲ级，基本属于恶性肿瘤，而且后期复发的风险非常高，预后不良。
通常情况下WHO分级在Ⅱ-Ⅲ的脑膜瘤称为侵袭性脑膜瘤。治疗方法包括手术和放化疗相结合。尽管该方法在其他实体肿瘤中成功率很高，但在脑膜瘤患者中进行化疗并未显示出明显疗效。因此，新型治疗方式，例如免疫疗法的研究是十分必须的。肿瘤浸润性T淋巴细胞（tumor-infiltrating T-lymphocytes ，TIL）在免疫治疗中起着至关重要的作用。
实验中对202例临床病例——123例原发性脑膜瘤（Primary Meningiomas，pMGM）和79例复发性脑膜瘤(Recurrent Meningiomas, rMGM）——中TIL含量进行定量分析，其中MGM的WHO高分型为97例 WHO°II，62例 WHO°III。组织样本标记为CD3，CD8，FOXP3和PD-1免疫荧光染色。
本文中海德堡大学医院神经外科的Dr Christel Herold-Mende及其团队评估了临床样本中TIL含量及其在pMGM和rMGM中的活化状态及其预后影响。文章发表在Clinical Cancer Research。通过定量分析发现，t细胞浸润极为不均匀，范围为0.01 - 24.88%，其中中位T细胞浸润占总细胞数量的0.59%。尽管在原发性脑膜瘤中辅助T细胞（CD3+CD8-FOXP3-）和细胞毒性T细胞（CD3+CD8+FOXP3-）没有发生明显的WHO分型变化，但较高数量的细胞毒性TILs与无进展生存(PFS)的改善相关，而不受预后混杂因素的影响。 复发性脑膜瘤的特征是T细胞总体数量减少，包括辅助T细胞和细胞毒性T细胞。在调查PD-1+CD8+ TILs的激活状态时，随着WHO级别的升高，TIL群体中PD-1+CD8+ TILs的比例显著降低，在rMGMs中也显著降低。此外，多变量分析中PD-1+CD8+ TILs比例较低与PFS较低相关，认为PD-1是激活而非衰竭的标志。
所以，更高数量的CD3+CD8+FOXP3-TIL和CD3+CD8+FOXP3-TIL中PD-1表达的的比例能够作为更高存活率的新型生物标志物。这些发现可能有助于选择可能受益于免疫治疗方法的患者，从而可以指导此类干预的最佳时机。
1 实验方法
在脑组织原位进行精准的量化分析，离不开不同脑区的划分。因为不同实验中动物的脑形态存在差异，研究目标所在的脑切片断面不统一，导致大部分定量仍然需要根据动物脑图谱的组织学分区，人工进行脑区标注，再分别统计各个脑区中的信息数据。TissueFAXS Cytometry技术结合了机器学习的人工智能方法，与根据参数调节的个性化分析手段，可以针对具有特殊识别标准的不同组织区域，进行自动识别。如果满足识别的条件，就可以实现自动化对某些脑区的智能圈选，特别适用于大量神经研究中的自动化批量操作，以及排除人为干扰的精准客观定量需求。
神经外科临床研究：202例脑膜瘤临床样本的多中心研究，全部实验仅需使用TG系统自动对组织切片中生物标记物进行定量与评估，分析结果更加可靠；尤其适合生物样本库等具有丰富临床样本的研究工作。
生物标记物Biomarker：四色荧光标记（CD3，CD8，FOXP3和PD-1）。
临床免疫治疗：免疫荧光检测细胞毒性T细胞和表达PD-1的细胞毒性TIL作为患者预后检测方法价格相对低廉。
肿瘤：T细胞浸润及其激活状态可预测肿瘤存活率或对化学疗法和免疫检查点抑制剂的反应。
2 实验步骤
实验利用StrataQuest软件，对T细胞浸润区域的免疫荧光标志物进行自动识别和定量分析。依据组织学分类手动定义感兴趣区域（ROI），排除相邻的正常脑区或坏死区域，筛选在肿瘤细胞含量高（≥60％）的区域中进行鉴定和定量。
TissueFAXS Cytometry定量分析技术以类流式散点图方式呈现识别的细胞，并在散点图中设GATE圈门筛选出有效细胞核（DAPI通道）及细胞表面marker（Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 555 通道）。基于样本各通道真实的荧光信号表达，严格限定细胞核大小、染色强度及背景阈值参数，结合正、反向回溯功能及cut-off线反复查看、校验细胞识别结果，以确保分析数据的准确性。
以上原理，作者分析了T淋巴细胞表面CD3、CD8抗体的共表达情况、FOXP3在细胞核内的定位情况以及CD3、CD8、PD-1抗体的共表达情况，并进行数据统计，分别计算以上阳性细胞在总的有效细胞及T淋巴细胞中的占比。
3 实验结果
Figure 1：原发性脑膜瘤中TILs定量分析数据
（A）CD3（紫色），CD8（绿色），FOXP3（黄色）和DAPI（蓝色）标记的原发性脑膜瘤样本免疫荧光图像。绿色箭头指向细胞毒性T细胞，白色箭头指向辅助性T细胞，黄色箭头指向CD4+调节性T细胞。
（B,C）CD3+TILs在WHOI-III型的原发性脑膜瘤定量分析。TILs的细分项效应性T细胞(D，E)和调节性T细胞（F）。
Figure 2：复发性脑膜瘤中TILs定量分析数据
（A，B）不同WHO分级的复发性脑膜瘤CD3+ TILs定量分析。TILs的细分项效应性T细胞(C，D)和调节性T细胞（E）。（F）原发性脑膜瘤和复发性脑膜瘤中效应性T细胞定量分析数据比较。
Figure 3: 原发性脑膜瘤中浸润PD-1-阳性 T细胞比例
（A）CD3（紫色），CD8（绿色），FOXP3（黄色）和DAPI（蓝色）标记的原发性脑膜瘤样本免疫荧光图像。绿色箭头指向PD-1+细胞毒性T细胞，白色箭头指向PD-1-细胞毒性T细胞。（B，C）原发性脑膜瘤中不同WHO分级的CD3+PD-1+TILs比例定量分析。（D）不同WHO分级的原发性脑膜瘤中PD-1+辅助性T细胞的比例（D）和PD-1+细胞毒性T细胞（E）的比例。
Suppl. Figure S2
以类流式散点图方式呈现识别的细胞，并在散点图中设GATE圈门筛选出有效细胞核（DAPI通道）及细胞表面marker（Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 555 通道）。