文章导读
ecDNA (extrachromosomal DNA)是从染色体上脱落下来的一种小型的DNA，即染色体外DNA。大部分染色体外DNA是以环状DNA的形式存在，因此又被称为eccDNA（extrachromosomal circular DNA）。近几年国际顶级学术期刊《Nature》和《Cell》连续发表里程碑式研究成果，揭示了ecDNA在肿瘤发生和发展中的重要功能，能够促进肿瘤细胞中原癌基因的表达，使之成为科研界关注的热点话题。最近，国内外科研团队在ecDNA领域相继取得重大突破。11月11日，云序客户郑州大学王立东教授团队，在Nature Communications上发表了国内首篇十分以上的ecDNA成果，建立了ecDNA与贲门癌预后的关系(国内首篇，15分！云序circle-seq助力国内首篇10分以上环状DNA研究）。11月24日，斯坦福大学Howard Y. Chang团队在1月份预印于bioRxiv的文章“EcDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression”正式发表于Nature。该文章对癌症细胞中ecDNA hubs（ecDNA聚集成簇）在致癌基因的表达中发挥重要的作用提出了一个新的分子机制，这为解析ecDNA在癌症细胞中的作用提出一个新方向，也为癌症治疗提供了新的理论基础。
发表日期：2021.11.24
实验方法: WGS，RNA-seq，ChIP-seq，ATAC-seq（以上服务云序均可提供）
文章链接：EcDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression
研究内容
此前研究发现ecDNA是大小约100kb-几Mb的双链环状DNA。由于其自身没有着丝粒，因此在细胞分裂中可随机分配到子细胞，这一特性使ecDNA在肿瘤耐药性方面发挥作用。而且，ecDNA也可以重新整合到染色体上或者形成重复序列（HSRs）。此外，ecDNA相比于染色体DNA有更加松散的结构，更适于其携带的致癌基因的转录和表达。ecDNA存在于正常染色体之外，其在细胞核中的空间组织目前还不清楚。但值得注意的是，ecDNA在某些生物学过程之后会发生聚集。本文中作者展示了由10-100个ecDNA聚集组成的ecDNA簇，它们聚集在间期细胞核内，驱动分子间增强子的重排从而驱动致癌基因表达。本研究中，通过检测在MYC-PVT1融合基因的ecDNA空间、表观和转录水平的动态变化，发现ecDNA hubs作为一个组合的增强子集合体，对致癌基因的转录发挥调控。研究结果
（1）ecDNA hubs是癌基因转录的主要位点为了了解ecDNA在转录过程中的空间背景，作者使用DNA荧光原位杂交技术（FISH）分别在前列腺癌（PC3）、结直肠癌（COLO320-DM）、胶质母细胞瘤（HK359）以及胃癌（SNU16）中可视化了ecDNA在间期期间在细胞核中的定位，发现这些ecDNA是几十到几百个聚集在间期细胞的细胞核的特定区域，这表明ecDNA 相互之间具有很强的聚集性，称之为ecDNA hubs。为了评估ecDNA hubs的转录活性，作者结合了DNA和新生RNA利用FISH检测了在PC3和COLO320-DM细胞系中MYC等位基因的转录活性，发现ecDNA hubs上致癌基因的转录的概率明显高于染色体位点，且发现MYC转录概率与ecDNA聚类之间有显著的相关性。因此，当更多的ecDNA在同一细胞聚集时，ecDNA hubs更有可能转录癌基因。
（2）单细胞水平识别与强效癌基因表达相关的ecDNA增强子
为了了解ecDNA上致癌基因表达的调控，作者在单细胞水平上鉴定了与癌基因高表达相关的ecDNA上的调控元件并检测了癌细胞的异质性，以及ecDNA与癌基因转录的关系。作者采用单细胞组学的方法，使用ATAC- seq和RNA-seq共检测到结直肠癌细胞系col320 -DM和COLO320-HSR中72049个细胞获得的转录组和染色质开放性图谱。进一步整合了每个细胞的转录组和染色质开放性图谱，发现MYC的开放性随RNA表达而增加。MYC在COLO320-DM中的表达与开放性相比于COLO320-HSR是高度异质的。这些结果表明，调控元件可以影响ecDNA在癌基因表达中的细胞间差异。为了鉴定细胞中表达高水平MYC的ecDNA上的活性调控元件，ATAC-seq比较表明，高MYC表达的COLO320-DM细胞既包含更高的ecDNA拷贝数，也包含更多的调控元件，在ecDNA上的差异峰分析鉴定出47个与MYC高表达密切相关的调控元件，而在染色体HSRs上鉴定出5个调控元件，这些结果表明，MYC 转录的增加与ecDNA中许多调节元件有关。总之，这些结果表明，细胞间增强子的差异可能是ecDNA 癌基因表达异质性的关键。
由于发现(i)细胞核内的ecDNA hubs与活跃的癌基因表达相关，(ii) ecDNA的癌基因表达与差异调节元件相关，作者下一步研究这些差异元件是否参与不同的ecDNA分子之间的增强子-启动子相互作用。作者整合了WGS、单分子DNA测序和3D 增强子连接体图谱，分析ecDNA hubs对致癌基因表达的调控。先根据之前的WGS的数据，检测COLO320-DM细胞中ecDNA在MYC位点有重排，确定了PVT1能和MYC的外显子2和3发生融合，并采用nanopore三代单分子测序的方法进行了验证，结果显示ecDNA分子在COLO320-DM中存在高度的异质性。随后采用HiChIP检测了COLO320-DM和COLO320-HSR中H3K27ac与激活型增强子和ecDNA的作用，发现在ecDNA的拷贝数高的COLO320-DM中H3K27ac与激活型增强子结合越紧密。此外，通过ATAC-seq鉴定了大量的激活型增强子，结果发现其与MYC基因有相互作用。综上结果，作者认为增强子和启动子之间的互作促进ecDNA的异质化和致癌基因的表达。
广泛的远距离接触和H3K27ac相关的DNA接触提高了BET蛋白可能参与ecDNA hubs转录的可能性。BET是染色质阅读蛋白，为了检测BET蛋白在ecDNA促进转录作用，检测在两种细胞中MYC位点BRD4的定位情况。根据H2K27ac，BRD4的ChIP-seq结果和ATAC-seq数据，表明H3K27ac 存在的激活的ecDNA增强子，与BRD4同时存在，BRD4连接ecDNA hubs，促进致癌基因的转录。为了评估BET抑制剂JQ1在ecDNA hubs的功能中作用，作者进行了JQ1处理，发现加入JQ1后ecDNA出现分散，且具有细胞特异性。而加入RNA PolII抑制剂，降低MYC的转录但不影响ecDNA hubs的聚集。通过新生RNA和DNA FISH和BRD4的ChIP-seq结果表明ecDNA hubs的形成依赖于BET蛋白，而ecDNA hubs的破坏会引起MYC致癌基因转录的抑制和ecDNA癌细胞的死亡。除了BET的抑制剂会抑制ecDNA的转录，作者还发现CRISPR的干扰剂，也可以抑制PVT1的启动子，降低PVT1-MYC的转录从而降低总的MYC的RNA水平。这一结果显示ecDNA可能是调控致癌基因表达的一个更有效的思路。
上述研究证明ecDNA hubs可能促进分子间增强子-启动子相互作用。为了验证这些相互作用，作者对人类胃癌细胞系中两种类型的ecDNA进行了研究，一种ecDNA包含来自8号染色体的MYC扩增子，另一种包含来自10号染色体的FGFR2扩增子。用FISH分析表明，MYC和FGFR2 ecDNA在间期中心区共表达。后续作者在细胞上使用H3K27ac HiChIP来检测增强子-启动子的相互作用。这些结果说明分子间的相互作用对于致癌基因的表达非常重要。
云序生物eccDNA测序
云序生物是国内最早提供环状DNA测序服务的公司，早在2018年已启动了环状DNA测序技术的开发。2019年，云序率先发布了组织细胞环状 DNA 测序（circle-seq），并成为A&A Bio独家代理（该品牌的环状 DNA 纯化柱被绝大部分环状DNA高分文章采用）。2020年，云序又相继发布了血清血浆环状DNA测序及血清血浆环状DNA甲基化测序服务，均为全国首发，并成为国内环状DNA产品线最全的测序公司。迄今为止，我们已经完成上千例样品的环状DNA测序，积累了丰富的项目经验，样品类型涵盖：组织﹑细胞﹑血清﹑血浆﹑尿液等，物种涵盖：人﹑小鼠﹑大鼠﹑拟南芥﹑果蝇﹑酵母﹑非洲爪蟾等。云序生物eccDNA相关产品
1.组织细胞环状DNA测序
云序生物基于circle-seq的方法，采用多种手段包括柱纯化去除基因组DNA、酶消化去除线性DNA和线粒体DNA、滚环扩增放大信号，高效地纯化和富集环状DNA，再利用NGS测序和生信分析识别环状DNA。结合优化的实验流程，本环状DNA测序服务具有检出率高﹑准确性好等优点。
云序生物eccDNA测序实验示意图
技术优势：
- 使用原装A&A biotechnology纯化柱高效富集环状DNA
- 滚环扩增放大环状DNA信号，提高检出率
- 专业的生信分析：详尽的注释、丰富的图表
针对血清血浆微量样品，云序生物参考卢煜明教授团队开发的方法，酶切去除线性DNA后，利用Tn5转座酶，打开eccDNA环状结构并同时在DN**段两端加上接头，进行建库及测序。Tn5转座酶法效率高，损耗低，实现血液循环系统中微量的环状DNA的检测。并且本产品能保留环状DNA的原始表达量，使得不同环状DNA间的表达量的比较更为准确。
技术优势：
- 减少DNA损失
- 保留原始表达量，不同环状DNA间表达量比较更准确
针对血清血浆样品，云序参考卢煜明教授团队今年研发的方法，酶切去除线性DNA后，利用Tn5转座酶，打开环状DNA环状结构并同时在DN**段两端加上接头，并用酶转化法将未甲基化的C转化为U，进行建库及测序。一次建库测序中同时检测样品中环状DNA及其甲基化位点的信息。
- 一箭双雕：同时检测环状DNA及其甲基化状况，节约样品，性价比高
- 单碱基分辨的环状DNA甲基化分析
针对测序项目中筛选出的环状DNA，云序提供sanger测序服务验证环状结构。其主要目的在于：为用户提供一种低成本的扩大样品量验证手段，节约实验成本。通过设计反向引物进行PCR扩增，将覆盖环状DNA连接位点的扩增产物进行sanger测序，验证连接位点处序列。
5.A&A Biotechnology 环状 DNA 纯化柱
A&A Biotechnology的纯化柱，是绝大部分环状DNA高分文章中所使用的纯化柱。云序生物是该品牌在国内的唯一总代理。
云序生物服务优势
优势一：首家提供环状DNA测序服务和环状DNA甲基化测序的公司。
优势二：环状DNA相关服务产品线最全的公司。
优势三： A&A Biotechnology 总代理，采用原装A&A Bio纯化柱，环状DNA 纯化效果好。
优势四：一站式服务：您只需按照送样要求向云序生物寄送样品，我们就能为您完成从环状DNA 提取，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。
优势五：严格质控流程：云序生物质控流程严格，层层把关，为客户提供高准确度的结果。
优势六：专业化生物信息分析：云序生物强大生物信息团队，满足客户个性化数据分析要求。
往期eccDNA主题回顾
上海云序生物科技有限公司
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