19年以来，染色体外环状DNA（extrachromosomal circular DNA）连续登上Nature，Cell等重磅期刊，成为了最新的前沿热点。近日，云序客户郑州大学王立东教授团队在环状DNA领域取得重大突破，在国际知名期刊Nature Communications（IF=14.92）上发表了环状DNA成果。云序生物也成为国内首家并且唯一有10分以上文章发表的 环状DNA测序（circle-seq） 服务平台。通过circle-seq等高通量测序技术，作者揭示了贲门癌中ERBB2，EGFR等致癌基因以环形DNA形式存在并形成了局部扩增，建立了ERBB2局部扩增与贲门癌预后之间的关系。
发表日期：2021年11月11日
影响因子：14.919
研究方法：环状 DNA 测序（circle-seq）、全基因组测序、全外显子测序、
文章链接：Focal amplifications are associated with chromothripsis events and diverse prognoses in gastric cardia adenocarcinoma
技术路线
研究背景
真核生物当中的染色体外环状 DNA 最早发现于半个多世纪以前，长期以来被认为与基因组的不稳定性有关。随着高通量测序技术的逐渐普及，越来越多的染色体外环状 DNA 被发现。在肿瘤研究中，ecDNA 表现出作为肿瘤内分区标志物以及肿瘤发展分期标志物的潜能。许多全基因组测序的数据分析表明，ecDNA 在不同癌肿瘤类型中具有特异性，并且与致癌基因的扩增以及癌症患者的不良预后存在关联。在癌细胞当中，不同染色体位点之间可能发生重排、连接和扩增，引发基因组的“局部扩增”（Focal amplification）。早前的研究显示，超过半数的肿瘤样本中的局部扩增事件，可以用 ecDNA 来解释。因此，在临床肿瘤样品中检测基因组的局部扩增现象，对于理解 ecDNA 在肿瘤中的功能具有重大意义。贲门位于食管和胃的交界处。食管胃结合部腺癌（Esophagogastric junction adenocarcinoma）是指起源于上消化道腺上皮并侵犯食管胃结合部的腺癌性病变。传统上，根据形态解剖上的特征，Siewert 分型法将食管胃结合部腺癌分为3型：Ⅰ型：远端食管腺癌，其范围自齿状线上5 cm至齿状线上1 cm；Ⅱ型：真正意义的贲门腺癌，范围自齿状线近心端1 cm至远心端2 cm内；Ⅲ型：贲门下腺癌，自齿状线下2～5 cm。目前，东西方学者对于如何定义食管胃结合部腺癌仍存在争议。在西方国家，因为巴雷特食管（Barrett’s esophagus，BE）病变高发，发生在食管和胃结合部的腺癌往往被诊断为 Siewert II 型食管胃结合部腺癌（Esophagogastric junction adenocarcinoma）。然而，在中国的太行山区的胃贲门腺癌（Gastric cardia adenocarcinom，后文简称为贲门癌）患者中，巴雷特食管病变的发生率很低，此地的贲门癌反而与食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma）更具相似性。
研究内容
一、全基因组测序发现局部扩增现象研究者首先对 36 例贲门癌组织进行了全基因组测序（WGS），通过 AmpliconArchitect 软件分析基因拷贝数异变（CNV）和局部扩增（Focal Amplifications）的情况。共计 28 位病人的 WGS 分析中有检出局部扩增现象，比例高达 77.8%（28/36），与其它研究报道中食管癌的局部扩增的比例（约 80%）相仿，但高于胃癌中局部扩增的比例（约 50%）。
图1.36 位贲门癌病人中有 28 位发生了局部扩增
使用 AmpliconArchitect 软件，研究者进一步将局部扩增的类型细分为环状 DNA 型、线性 DNA 型、复杂型、“断裂-融合-桥”型以及其它。对于其中的环状 DNA 型局部扩增，研究者使用另一种软件 Circle-finder 进行了独立验证，发现 AmpliconArchitect 方法所发现的环状 DNA 绝大多数都能在 Circle-finder 中验证（Fig1），说明软件对环状 DNA 的预测是真实可靠的。
图2.AmpliconArchitect 发现的环状 DNA 绝大多数能被 Circle-finder 验证
随后，研究者对所有的局部扩增位点进行了基因组注释，发现其中绝大多数位点位于蛋白质编码区；除此以外，局部扩增在lncRNA 基因区、miRNA 基因区、snRNA 基因区、snoRNA基因区、rRNA 基因区等均有分布；值得注意的是，也有 82 个局部扩增事件发生在致癌基因区域。
图3. 局部扩增位的基因组区域注释
研究者对这些发生在致癌区域的局部扩增事件进行了统计排序，发现发生在 CCNE1 基因的局部扩增事件的频率最高，ERBB2 基因紧随其后，后文中扮演重要角色的 EGFR 基因上发生局部扩增事件的频率也不低。研究者利用 TCGA 数据库中的公开数据，在食管癌、贲门癌、胃癌这三种临床上相似的癌症之间，比较局部扩增事件出现在各致癌基因上的频率排序，发现贲门癌与胃癌近似（前两名都是 CCNE1 和 ERBB2），但与食管癌有差异。研究者进一步发生了局部扩增的对环状 DNA 进行分类，将含有两个或以上致癌基因的环状 DNA 的局部扩增称为“共扩增”（co-amplification），单个致癌基因来源的则为“非共扩增”（none co-amplification）。依照这一分类标准，可以发现：
（1）超过一半病人有发生两个或以上致癌基因的“共扩增”现象；
（2）在发生了“共扩增”的病人当中，”共扩增“在所有局部扩增事件中所占的比例很高，从50%到100%不等；
（3）有一些致癌基因的“共扩增”组合，例如 ERBB2 和 CDK12 的组合，RARA 和 SMARCE1 的组合等，在多个病人当中发生；
（4）EGFR 和 CDK6 的“共扩增”组合，这两个致癌基因在基因组上的距离长达 40 Mbp，但仍形成了一个环状DNA，并且其局部扩增水平相较于基因组其他区域高出了 40 倍之多。
以上现象强烈暗示，同一个环状 DNA 上共扩增的多个致癌基因，可在贲门癌发展过程中共同发挥作用。
图4.致病基因的“共扩增”现象在各个病例中的分布
图5.致癌基因 EGFR 和 CDK6 在同一个环状 DNA 上共扩增
二、环状 DNA 测序验证环状局部扩增事件的真实性
为了验证 AmpliconArchitect 软件预测的环状 DNA 型局部扩增事件的真实性，研究者将前述 36 位贲门癌患者当中的 10 份贲门癌组织及其癌旁正常组织送来云序生物进行了环状 DNA 测序（circle-seq）。在 circle-seq流程中，采用 A&A Biotechnology 的纯化柱进行环状DNA富集，并辅以外切酶消化，能大大消除线性 DNA 的干扰，保留高纯度的环状 DNA 用于测序。在这 10 份样品中，AmpliconArchitect软件预测认为其中 4 份贲门癌组织样品发生了环状 DNA 型局部扩增，另外 6 份贲门癌组织样品则没有。Circle-seq 结果显示，10 份贲门癌组织中均有检出环状 DNA 的存在。对于 4 份软件预测认为存在环状 DNA 型局部扩增的贲门癌样品，绝大多数原先预测存在的环状 DNA 都被 Circ-seq 验证发现真实存在。对于局部扩增频率最高的致癌基因 CCNE1，在 2 份样品中，Circle-seq 实验结果和 AmpliconArchitect 软件预测都认为 CCNE1 发生了局部扩增；但在所有的正常组织样品中，Circle-seq 和 AmpliconArchitect 软件预测都认为不存在 CCNE1 的局部扩增事件——这进一步验证了 AmpliconArchitec 软件预测的可靠性。
图6.四例（S25、S26、S30、S31）AmpliconArchitect 软件认为存在环状 DNA 型局部扩增的病例当中，绝大多数环状 DNA 都可被 Circle-seq 实验结果验证
那么，6 份基于 WGS 数据进行软件预测认为没有发生环状 DNA型局部扩增的贲门癌组织样品，为何在 Circle-seq 当中也检出了环状 DNA 的存在呢？原来，环状 DNA 可以被细分为 ecDNA 和 eccDNA，其中 ecDNA 长度较长、拷贝数较高（本文定义为拷贝数>=7），大量研究已经证明 ecDNA 与肿瘤的发展和耐药性有关；eccDNA 长度较短、拷贝数较低（本文定义为拷贝数<7），在真核细胞当中普遍存在，与肿瘤的关系不大。在本研究中，在6份基于 WGS 数据进行软件预测认为没有发生环状 DNA型局部扩增的贲门癌组织样品里面，有 4 份当中的环状 DNA 全都是与肿瘤无关的 eccDNA（S21、S28、S29、S32），因此 AmpliconArchitect 软件其实相对准确地预测出了与肿瘤息息相关的 ecDNA 的存在。
图7.四个病例（S21、S28、S29、S32）当中 Circle-seq 检测到的环状 DNA 均为与肿瘤无关的eccDNA
三、染色体碎裂是局部扩增的原因
虽然局部扩增现象在多种癌症中都已被发现，但造成局部扩增事件发生的原因，仍然扑朔迷离。"染色体碎裂"（Chromothripsis ，或 Chromosome shattering）是染色体的大片区域发生大规模的重新排列的现象。染色体碎裂使得染色体小片段重新排列，并重新连接，导致形成新的基因组配置。有文献报道认为，染色体碎裂促使来自不同染色体位点的 DNA 重排片段并列在一起，有助于癌症的进展。并且，在染色体碎裂的过程中，伴随有局部扩增事件以及 ecDNA 扩增子的发生。
因此，研究者下一步就探究了贲门癌中染色体碎裂与局部扩增事件之间的关系。对于前述的 36 例贲门癌 WGS 测序数据，研究者使用 ShatterSeek 软件包鉴定其中的染色体碎裂事件，发现其中 34 例个案发生了染色体碎裂。研究者进一步制定标准将染色体碎裂事件细分为“高可信度染色体碎裂”（HC）和“低可信度染色体碎裂”（LC），发现高达61%的个案中存在 HC 事件，而 LC 事件更是在接近 90% 的个案中存在。然而，这些染色体碎裂事件的发生次数以及染色体位置却不存在特征规律，在不同个案之间差异很大。作者随后比较了染色体碎裂以及局部扩增发生的染色体位置，发现二者在多个致癌基因处都有发生。统计显示，总计有高达 33.11% 的局部扩增事件发生的位点处也发生了染色体碎裂事件，染色体碎裂与局部扩增之间皮尔森关联系数达到 0.42，暗示染色体碎裂很可能是局部扩增发生的一种重要来源。由此，作者推测认为，在贲门癌中，很可能是因为染色体的碎裂，引发了局部扩增事件的增加，进而促进了贲门癌的发展。
图8.染色体碎裂与局部扩增之间存在正相关关系
四、亚硝胺引发的DNA 损伤是染色体碎裂的原因
那么，又是什么原因导致了染色体的碎裂呢？早前的研究显示，染色体碎裂与基因组的不稳定性以及 DNA 损伤有关。研究者对多种可能造成基因组不稳定和 DNA 损伤的原因进行了逐一排查，排除了微卫星不稳定性（MSI）和染色体不稳定性（CIN）在贲门癌中造成染色体碎裂的可能性，但发现 DNA 双链断裂与贲门癌高度相关——在 34 例发生了染色体碎裂的个案当中，有 29 例通过免疫组化实验检出了 DNA 双链断裂的指标蛋白 γH2AX；并且，在唯二未发生染色体碎裂事件的个案中，均未检出 γH2AX，说明 DNA 双链断裂指标蛋白 γH2AX 与染色体碎裂事件的发生高度正相关。研究者还发现，γH2AX 阳性个案当中的染色体碎片长度比 γH2AX 阴性个案中更长，与先前提到的癌症相关的 ecDNA 长度更长的特征不谋而合。因此，作者推测，在贲门癌中，很可能是因为 DNA 双链的断裂，引发了染色体碎裂事件的增加，进而促进了贲门癌的发展。
图9. DNA 双链断裂指标蛋白 γH2AX 与染色体碎裂事件的发生高度正相关
追根溯源，那么究竟又是什么原因导致贲门癌患者的 DNA 双链发生断裂呢？作者观察到，原来本研究中所收集的贲门癌病例，均来自中国河南省的太行山区，该地区是贲门癌的高发区域。太行山区的居民喜食酸菜等富含DNA 烷化剂亚硝胺的食物，作者推测认为，很可能是因为当地居民的饮食传统导致了亚硝胺的摄入过量，进而引发 DNA 损伤-染色体碎裂-局部扩增，最终导致了贲门癌的高发。
在多种癌症中都有研究报道，ecDNA 与致癌基因的扩增以及癌症的不良预后高度相关。沿着这一思路，研究者在贲门癌中，探究了致癌基因拷贝数、局部扩增事件、病人预后情况三者之间的关系。
首先，研究者考查了致癌基因拷贝数与贲门癌与预后之间的关系。在贲门癌的 11 个出现频率最高的致癌基因当中，研究者将这些致癌基因在各个贲门癌病人中的拷贝数分为高、中、低三档，发现局部扩增的致癌基因的拷贝数普遍较高。对于 EGFR、MYC、BIRC3 这几个致癌基因，高拷贝数预示着病人较短的存活时长；然而，对于CCNE1、ERBB2 等致癌基因，高拷贝数却预示着病人较长的存活时长。
图10.基于 WGS 数据的局部扩增分析显示，EGFR 高拷贝病人存活时间短，CCNE1、ERBB2 高拷贝病人存活时间长
为了更好地确认致癌基因拷贝数与贲门癌病人存活时长之间的关系，研究者在前述 36 例贲门癌病人的基础上，额外追加了另外 39 例贲门癌病人，对共计 75 例病人进行了全外显子测序（WES）。结果显示，36 例进行了两种测序的个案当中，WGS 和 WES 检出的致癌基因拷贝数基本吻合，说明前述基于 WGS 数据所做的研究是可靠的；全体 75 例贲门癌病人的 WES 结果也显示，ERBB2 的扩增预示着病人较长的存活时长。除此之外，作者还从 TCGA 数据库中获取公开病例数据，在贲门癌病人中，EGFR 高拷贝病人存活时间短，ERBB2 和 CCNE1 高拷贝病人存活时间长，与之前发现的规律相同。由此说明，作者先前得出的致癌基因拷贝数与病人存活时长之间的规律关系是具有普适性的，并非先前 36 例小范围样本中的个别现象。
图11.ERBB2 基因的拷贝数与病例生存期之间的关联关系。左：基于 WES 数据；右：基于 WGS 数据。
随后，研究者又考查了致癌基因局部扩增事件与贲门癌预后之间的关系。CCNE1 的局部扩增与病人预后之间没有显著相关关系；EGFR 的局部扩增预示着较短的存活时长；而 ERBB2 的局部扩增则预示着较长的存活时长。
图12. 不同致癌基因局部扩增事件与贲门癌预后之间的不同关系
研究者试图将致癌基因 ERBB2 对贲门癌预后的影响精确到详细的癌症分期，但因为测序研究的样本量太小，不足以得出统计学上有说服力的结论。虽然缺乏大规模的贲门癌测序研究的机会，但郑州大学第一附属医院自1973 年以来，收集了数以千计的贲门癌样本。研究者从 1668 份贲门癌样本进行了免疫组化实验，检验其中是否存在 ERBB2 蛋白的表达。对于术后存活时长超过两年的个案而言，免疫组化 ERBB2 阳性的患者的生存率要高于ERBB2 阴性的患者。研究者先前已经发现， ERBB2 的蛋白表达水平与 RNA 表达水平之间的皮尔森关联系数高达0.79，具有很强的正相关关系。假若 ERBB2 的局部扩增可导致 ERBB2 蛋白的表达水平升高，那么 ERBB2 局部扩增或将可在临床实践中作为贲门癌良好预后的一个生物标志物。有文献报道，食道鳞癌当中的 ERBB2 蛋白表达水平也与患者的生存率正相关，由此也暗示了贲门癌与食道癌之间的相似性。