Illumina 850k (EPIC)甲基化芯片服务

DNA的甲基化修饰是表观遗传研究中的一个热点，在基因调控过程中扮演着重要的角色。它在维持组织特异性表达谱，使细胞获得并保持特定状态中起着重要作用。同时也调控着染色质稳定性、印迹基因表达调控、X染色体失活及抑制病毒和外源基因的表达等生物过程。更重要的是，在许多复杂疾病或生命过程的发生、发展中，也与DNA甲基化对基因的表达调控密切相关，这些疾病包括：癌症、神经系统紊乱、老化以及发育。

      Illumina在原450K芯片巨大成功的基础上，推出了新一代的DNA甲基化芯片Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片（下文中以850K芯片代称），为研究者提供了一个可靠且经济高效的甲基化分析平台。850K芯片可检测人全基因组约853,307个CpG位点的甲基化状态，其中包含了原450K芯片91%的位点，并增加了413,745个位点（图 1）。850K芯片不但保持了对CpG岛，基因启动子区的全面覆盖，还特别加强了增强子区（新增了333,265个探针覆盖来自ENCODE及FANTOM5计划的增强子）以及基因编码区的探针覆盖。广泛应用于干细胞研究、肿瘤和其他复杂疾病研究，是目前非常适合表观基因组全关联分析研究的全基因组DNA甲基化芯片。

芯片特点：

• 覆盖全面：检测853,307个CpG位点；全面覆盖CpG岛、启动子、编码区及增强子。
• 无需“甲基化DNA免疫共沉淀”，亚硫酸氢盐处理基因组DNA即可进行芯片实验； Infinium探针设计，直接识别甲基化位点；
• 技术重复重现率>98%；
• 操作简单，无须PCR扩增；模板量可低至250ng；
• 适用于FFPE样品。

Infinium Methylation EPIC BeadChip芯片对全基因组的全覆盖

      850K芯片对基因组的功能元件提供了空前全面覆盖：CpG岛、RefSeq基因、ENCODE开放染色质、ENCODE转录因子结合区以及FANTOM5增强子。**的Infinium HD技术的保证了目标区域超高密度覆盖，同时还避免了甲基化DNA捕获方法具有偏向性的缺点。850K芯片的一大特点是增加了很多由ENCODE项目中鉴定出来的潜在增强子。（ENCODE通过全面分析开放染色质、FAIRE实验、转录因子结合区域，整合出基因组中活跃的区域。）最后，芯片还覆盖了FANTOM5项目鉴定得到的不同组织类型中的增强子。下图及表格统计展示了850K芯片对于不同染色体、基因组功能元件的覆盖及分布。以上的设计不但可从泛-增强子及编码区域角度分析甲基化组，还在全基因组表观遗传关联研究（EWAS）中发挥重要作用。850K芯片中所包含的系列有价值的位点：

• CpG岛以外的CpG位点
• 人类肝细胞中的非CpG甲基化位点（CHH位点）
• 肿瘤（多种类型的癌症）VS正常样本中的不同甲基化位点，可以检测多种样本类型
• FANTOM5增强子
• ENCODE开放染色质和增强子
• 脱氧核糖核酸酶超敏位点
• miRNA启动子区域
• 涵盖Infinium Methylation 450 BeadChip芯片中的＞90%的内容

芯片数据的可靠性

      Methylation EPIC BeadChip沿用了在450K芯片中取得成功的Infinium I及II探针设计（Figure 4）,以达到保证数据稳定可靠的同时也达到对目标区域全面覆盖。Infinium II探针对目的CpG位点采用单个探针且序列中包含简并碱基设计，即使序列中有多达三个CpG位点的甲基化状态影响也不会对目的位点的结果造成影响。Illumina的科学家严格检测每个产品，以确保强大而重复的性能，让研究人员能够实现行业**的数据质量。
 

（1）Infinium Ⅰ 探针设计

（2）Infinium Ⅱ 探针设计

      Infinium Ⅱ 探针只使用一种磁珠，探针末端为C，与目的位点的前一个碱基配对，只延伸一个碱基（ ddNTP-BioT， ddNTP-DNP）分别与非甲基化或甲基化位点配对。根据两种荧光类型及计算目的位点的甲基化程度。
基于Infinium平台的可靠性，850K芯片表现出非常完美的重复相关系数（r2＞0.98），而且850K芯片与450K芯片相同的位点的重复r2＞0.98，为850K与450K数据的整合分析建立了基础。此外通过比较8个生物学样品的重复的结果，850K芯片能可靠检测0.2的delta-beta值，且假阳性率低于1%。此外，芯片中设计了样品依赖和样品不依赖的内参以保证数据的高质量，例如专为亚硫酸氢盐转化后而复杂度降低序列而设计的阴性对照。

850K芯片适用于FFPE样品的甲基化研究

      Illumina为FFPE样本的检测改进了protocol，以获得更可靠成稳定的结果。通过与新鲜样本的比较，可见虽然FFPE样本的检出率受到样本质量的影响而下降，但FFPE样本的技术重复的相关性R平方仍然高达0.98。对同一份样本的冰冻样本及FFPE样本的结果比较发现两者相关依然很高（R=0.994）。

三、样本要求：

样品类型：组织、细胞、基因组DNA

• 样品纯度：OD 260/280值应在1.7～2.0 之间；RNA 应该去除干净；不得有其它个体或其它物种的DNA污染。
• 样品浓度：浓度不低于50ng/μl；
• 样品总量：每个样品总量不少于2μg 。
• 样品溶剂：溶解在TE中。
• 样品运输： DNA低温运输（-20℃）；在运输过程中请用parafilm将管口密封好，以防出现污染。

四、数据分析

       详细内容同450K数据分析内容，详见链接：http://www.shbio.cn/product/30.html

Agilent DNA甲基化芯片服务

Agilent DNA甲基化芯片服务

Agilent 的甲基化芯片通过SurePrint芯片合成**技术，优化探针设计及实验方法，可灵活进行甲基化研究，得到高灵敏度、高特异性、高重复性的结果。

芯片推荐：Agilent Human CpG Island Microaray 1x244K
芯片介绍：覆盖27,800个人类CpG岛，参考数据库为：UCSC hg18 (NCBI Build 36.1, March 2006)。

芯片推荐：Agilent Human DNA Methylation Microarray 1x244K
芯片介绍：覆盖27,627个人类CpG岛和5081个UMR区域，参考数据库为：UCSC hg18 (NCBI Build 36.1, March 2006)。

芯片推荐：Agilent Mouse CpG Island Microarray, 2x105K
芯片介绍：覆盖16,030个小鼠CpG岛，参考数据库为：UCSC mm8 (NCBI Build 36, February 2006)。

Shbio DNA甲基化芯片服务

Shbio DNA甲基化芯片服务

芯片推荐：SBC 人类全基因组CpG 岛芯片服务
芯片介绍：本甲基化芯片针对基因组中所有的GC%>57%，长度>250bp的46957个CpG岛而设计，覆盖全基因组中的CpG岛。甲基化芯片由本公司自行开发设计，Nimblegen公司合成，包括两有套设计方案：探针位于CpG岛内或位于岛外，每张芯片上总共含有392778个探针。具有覆盖率广、敏感度高、精确度高的特点。 芯片通过特异性结合甲基化DNA的蛋白-MBD2b，富集基因组中的甲基化DN**段，再通过接头放大标记后进行芯片分析。

BSP &MSP服务

BSP服务针对少数的已知基因或位点设计，根据亚硫酸氢钠处理后甲基化的胞嘧啶C不变，而普通胞嘧啶变成U的原理，设计引物扩增经亚硫酸氢钠处理后的样品，通过判断PCR是否能扩增或通过测序确定目的片段中的CpG位点的甲基化状态。

MSP服务原理与BSP类似，通过甲基化敏感的限制性内切酶切割与PCR相联，研究酶切位点的甲基化状态。

BSP Microarray服务

通过亚硫酸氢钠处理后甲基化的胞嘧啶C不变，而普通胞嘧啶变成U的原理，对目的片段内的各位点设计相应的探针，检测其甲基化状态。适于研究中大量样本的目的片段，具有方便快捷，灵敏度高的优点。