截至目前，超过5种CAR-T细胞治疗产品获得美国FDA认证，批准上市。国内首款CAR-T产品也已获批上市。但CAR-T产品也存在着生产周期长、有细胞因子风暴及神经毒性副作用等挑战。

CAR-NK细胞被认为可能应对这些挑战，其发展引起了研究人员的极大兴趣——主要是因为相比传统的CAR-T细胞，CAR-NK细胞具有独特的优势。与CAR-T细胞不同，CAR-NK细胞可以应用于异体细胞治疗环境，这意味着它有潜力成为一种“现成的”治疗方法，并降低移植物抗宿主病(GVHD)的风险，解决了周期长，必须应对个体化需求的问题。CAR-NK细胞不像CAR-T细胞那样在体内长时间存活，从而降低了靶向正常细胞和非肿瘤细胞的风险。此外，由于NK细胞分泌的细胞因子相与T细胞不同，NK细胞造成细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性的风险较低。

更重要的是，CAR在NK细胞中的表达可以增加其固有的细胞杀伤能力，改善未修饰前NK细胞的治疗结果。已知未修饰的NK细胞临床前研究已经产生了很好的结果及安全性，但仍未转化为成功的临床实验，虽有多达50%的患者中产生了阳性反应，但其他实验报告的临床疗效还是有限。提示我们CAR修饰的NK细胞治疗可能是更好的治疗方案。

慢病毒NK细胞转染方案

限制CAR-NK细胞治疗发展的挑战之一是基因转染方式。逆转录病毒载体已被广泛研究，转染后在NK细胞中的效率约为27%-52%。以及转染后CAR-NK细胞活力低和突变的风险而受到限制。一种更安全的选择是用慢病毒(LV)转染，因为它提供了降低基因毒性和插入突变的风险。然而，其转染效率往往比逆转录病毒的转录效率要低得多。

CAR-NK细胞有几种类型的慢病毒(LV)正在开发中，最近人们对优化vesicular stomatitis virus-G (VSV-G)-pseudo typed LV(VSV-G LVs)的转染很感兴趣。

St. Jude儿童研究医院的研究人员于2021年6月在Cytotherapy杂志发表文章，研究表明，VSV-GLVs转染的NK细胞转染效率低和细胞活力低是由于toll样受体4(TLR4)通路的激活。

VSV-G激活TLR4信号通路

免疫系统使用模式识别受体，如toll样受体，来识别细菌和病毒的病原体相关分子模式(PAMPs)。TLR4以其能够识别革兰氏阴性菌外膜上的脂多糖(LPS)而闻名，也能识别病毒。

NK细胞在细胞表面和细胞内均表达TLR4，使得NK细胞对VSV-GLV激活TLR4通路特别敏感。VSV-G激活胞内TLR4信号通路，从而诱导信号级联，最终导致I型干扰素的产生。基于以往的研究，我们认为VSV-GLV的转染效率较差，可能是由于TLR4通路的激活所致。因此，Chockley等人研究了使用药物MRT67307抑制TLR4通路的下游信号分子TBK1和IKKε。

单细胞功能蛋白质组技术评价基因编辑的NK细胞

研究表明，在转染方案中使用MRT67307，显著提高了NK细胞中HER2-CAR的转染效率，高达18%-53%的细胞表达CAR（图1），平均数为34%。

图1：CAR表达百分比

此外，作者在针对HER2+A549细胞系的4小时细胞毒性实验中评估了CAR的功能，HER2-CAR NK细胞表现出对肿瘤细胞的显著杀伤。在MRT67307的存在下，转染的HER2-CAR-NK细胞的肿瘤杀伤力显著提高（图2）。

图2：共培养细胞毒性实验

研究者使用IsoPlexis的单细胞分泌组解决方案评估HER2 CAR-NK细胞的细胞因子分泌谱。与未修饰的NK细胞相比，两种细胞的多功能性（分泌两种及两种以上因子的能力）存在显著差异，主要表现在未经修饰的NK细胞平均分泌2-3个效应分子，其中不到13%的细胞分泌颗粒酶B，少于3.5%的细胞分泌其他细胞因子，多功能细胞占整个细胞的比例小于20%；而HER2 CAR-NK细胞中的部分亚群则能够产生多达10种效应分子，细胞分泌一系列的效应细胞因子，包括：颗粒酶B、穿孔素、TNF-α、MIP1-β、MCP-1、RANTES和IL-8，其多功能细胞占比超过50%（图3）。

图3：NK细胞多功能性，细胞因子谱，多功能指数的差异。

本研究的数据表明，抑制TBK1和IKKε显著改善了NK细胞的转导，并产生了功能完整的细胞产物，与未修饰的NK细胞和没有MRT67307转导的NK细胞相比，CAR-NK细胞表现出更优越的细胞毒性能力。

利用IsoPlexis的单细胞蛋白质组学平台发现的数据，作者能够表征使用VSV-Glv转基因NK细胞的可靠性。该研究的NK细胞转导方法有可能适用于异源基因CAR-NK细胞治疗的临床生产，这在现成的细胞治疗研究领域具有重大的意义。